2.2 VhPLD對不同磷脂單分子層的吸附動力學參數

單分子層最適合用來模擬細胞膜結構，基于此模型不僅可以研究界面酶分解脂質的動力學，還可以通過跟蹤脂質分子面積的變化來研究蛋白質在磷脂單分子層上的吸附動力學，其中脂質分子面積的變化直接由界面表面壓力的增加值(ΔΠ)進行精確監(jiān)測[11-12]。磷脂分子是兩親性結構，由疏水性的?；溛捕撕鸵粋€極性頭所組成。當含有磷脂的氯仿溶液滴加到水相表面時，隨著氯仿有機溶劑的揮發(fā)，磷脂分子自然鋪展開來，隨即形成磷脂單分子層膜。單分子層技術正是基于該原理進行單分子層的制備，同時，利用高靈敏度探針精確測量磷脂單分子層的表面壓力變化。選取常見的幾種磷脂(PC、PE、PS、PG和PI)，測量VhPLD對不同磷脂的吸附動力學參數。同時，嘗試比較不同初始表面壓力條件下，酶蛋白吸附動力學參數的變化。對于不同的磷脂單分子層，選定的蛋白濃度范圍為10～250 nmol/L，在不同的Πi下進行一系列的吸附動力學測定。

2.2.1單一初始表面壓力條件下VhPLD對不同磷脂單分子層膜的吸附動力學參數

由于膜組分通常形成水不溶性單分子層，因此膜表面濃度被定義為單位面積上界面的物質量。膜表面壓力π被定義為水相表面張力(γ0)與薄膜覆蓋表面的表面張力(γf)之差，其中γ0為72.8 mN/m[13]。表面壓力是表征磷脂單分子層的一個重要的參數。Boisselier等[14]提出影響蛋白與脂質單分子層結合的因素有很多，如下相中緩沖液的組成、脂質膜的性質、蛋白的性質等。

在初始表面壓力為15 mN/m的條件下(見圖2)，VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附常數分別為(1.19±0.02)×104、(6.69±0.55)×103、(8.51±0.93)×103、(3.59±0.17)×103、(2.89±0.35)×103mol/(L·s)。VhPLD對不同磷脂單分子層膜的吸附常數之間存在顯著性差異(P<0.05)，其中，吸附常數最大值出現在PC，最小值出現在PI。吸附常數值越大，表明酶蛋白越容易吸附到磷脂質-水界面上。VhPLD對PC、PE、PS的解離常數分別為(2.99±0.20)×10-3、(3.67±0.50)×10-3、(3.82±0.81)×10-3s-1，統(tǒng)計學分析表明3組數據之間無顯著性差異(P>0.05)。而VhPLD對于PG和PI的解離常數分別為(1.17±0.24)×10-3s-1和(1.77±0.48)×10-3s-1，統(tǒng)計學分析表明2組數據之間無顯著性差異(P>0.05)。然而，VhPLD對PC、PE和PS的解離常數與對PG和PI的解離常數之間存在顯著性差異(P<0.05)。解離常數越小，表明酶蛋白與磷脂結合越緊密，不容易從界面上解離下來，反之，表明酶蛋白越容易與磷脂分離。在初始表面壓力15 mN/m條件下，該酶對PC具有最大的吸附平衡常數((3.98±0.01)×106mol/L)，其次是PG((3.07±0.15)×106mol/L)，相反地，對于PE和PI的吸附平衡常數僅為(1.82±0.15)×106mol/L和(1.63±0.20)×106mol/L。吸附平衡常數反映的是酶對磷脂的親和力(或者是偏好性)大小，吸附平衡常數值越大，表明酶對磷脂的親和力越大，反之，親和力越小。以上結果表明，在初始表面壓力為15 mN/m的條件下，VhPLD對PC的親和力最強，而對于PE和PI的親和力最弱。在初始表面壓力15 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為PC>PG>PS>PE=PI。

圖2初始表面壓力15 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數

在初始表面壓力為20 mN/m條件下(見圖3)，與VhPLD在初始表面壓力為15 mN/m條件下對不同磷脂的吸附常數趨勢相同，VhPLD對PC的吸附常數最大((1.57±0.19)×104mol/(L·s))，其次為PS((1.26±0.10)×104mol/(L·s))。VhPLD對PG和PI的ka值分別為(3.72±0.12)×103mol/(L·s)和(3.49±0.35)×103mol/(L·s)，均顯著低于其他磷脂底物。然而，在20 mN/m條件下，VhPLD對于PE的解離常數((8.48±1.31)×10-3s-1)明顯高于PC((3.80±1.40)×10-3s-1)和PS((4.26±0.97)×10-3s-1)，該結果與在15 mN/m條件下結果有較大差異。VhPLD對于PG和PI的吸附平衡常數分別為(5.43±0.02)×106mol/L和(5.12±0.05)×106mol/L。該結果表明在初始表面壓力20 mN/m條件下，酶對PG的親和力最大，其次為PI，而對于PE的親和力最小，吸附偏好性順序依次為PG>PI>PC>PS>PE。

在初始表面壓力為25 mN/m的條件下(見圖4)，VhPLD對PC的吸附常數最大((1.46±0.10)×104mol/(L·s))，對于PG((3.58±0.31)×103mol/(L·s))和PI((4.30±0.34)×103mol/(L·s))的吸附常數最小。在該初始表面壓力條件下，VhPLD對于PC、PE和PS的解離常數之間不存在顯著差異(P>0.05)，該結果與在15 mN/m所測定的結果保持一致。而在該條件下獲得的VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為PC>PS>PI>PE=PG。

圖3初始表面壓力為20 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數

圖4初始表面壓力為25 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數

2.2.2不同初始表面壓力條件下VhPLD對單一磷脂的吸附動力學參數比較

相比于15 mN/m的初始表面壓力條件，VhPLD在20 mN/m和25 mN/m條件下對PC、PE和PS的吸附常數均顯著高于15 mN/m條件下相應的ka值(P<0.05)，VhPLD在20 mN/m和25 mN/m條件下ka之間卻沒有顯著性差異(P>0.05)。而對于PG而言，不同初始表面壓力條件下ka之間沒有顯著性差異(P>0.05)。相反的，VhPLD在25 mN/m條件下PI的ka與在15 mN/m和20 mN/m條件下均有顯著性差異(P<0.05)。

對于解離常數，除了在20 mN/m條件下對PE的kd值顯著高于15 mN/m和25 mN/m條件下外，其他磷脂底物在不同初始表面壓力下的kd值之間均沒有顯著性差異(P>0.05)。

不同初始表面壓力條件對VhPLD的磷脂吸附親和力具有較大的影響。對于PC及PS而言，親和力隨著表面壓力的增加而逐漸增大，對于PE來說，其在20 mN/m條件下的親和力要顯著低于其他表面壓力條件下的值，主要原因是由于在此表面壓力條件下的kd值變大引起的。而對于PG和PI，最大的親和力出現在20 mN/m條件下，主要是由于在此條件下酶的解離常數降低所導致。

3、結論

酶蛋白對于磷脂質-水界面的吸附動力學參數與磷脂單分子層的種類及不同初始表面壓力狀態(tài)密切相關。在15 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為磷脂酰膽堿>磷脂酰甘油>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰乙醇胺=磷脂酰肌醇；在20 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為磷脂酰甘油>磷脂酰肌醇>磷脂酰膽堿>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰乙醇胺；而在25 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序則轉變?yōu)榱字Ｄ憠A>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰肌醇>磷脂酰乙醇胺=磷脂酰甘油。該結果提示在表征酶對不同磷脂吸附動力學參數的時候，必須要強調所處的表面壓力條件，否則單純評價對于不同磷脂的吸附動力學參數是沒有意義的。

LB膜分析儀應用：不同初始表面壓力條件對VhPLD的磷脂吸附親和力影響（一）

LB膜分析儀應用：不同初始表面壓力條件對VhPLD的磷脂吸附親和力影響（二）